GUÍA DE
VALIDACIÓN DEL MÉTODO COLORIMÉTRICO PARA EL ANÁLISIS DE NITRITOS EN AGUA.
Ríos, R.1;
Fuentes, M.2
1Estudiante de Educación y Sociedad, Escuela de Educación,
Universidad Autónoma de Chiriquí, UNACHI
2Facilitadora del curso Educación y Sociedad, Escuela de Educación, Universidad
Autónoma de Chiriquí, UNACHI
rrckhgs10@hotmail.com
ABSTRACT.
The following
work translates into a real validation, in a way that a form of validation is
performed can be learned and verified by the participants, so the validation of
the colorimetric method, used in the determination of nitrites, the matrix is
performed it was drinking water, taken from the Standard Method for the
Examination of Waters and Wastewater (2012), adapted to the manual of
analytical procedures of the "laboratory". The study was carried out
in the Laboratory of Water and Physical and Chemical Services (LASEF). The
quality criteria that were estimated were linearity, work intervals and linear
interval, accuracy and veracity. In the linearity evaluation, a correlation
coefficient r = 0.9978 and the coefficient of determination, R2 = 0.9958; they
meet the acceptance criteria and a good correlation between signal and
concentration. In the estimation of the precision the coefficients of total
variation were obtained 2.99% for the accuracy of the days and different
analysts, values below the limit of 0.4578. As for the veracity, recovery
percentages between 95 and 102% are obtained, evidence of an excellent
veracity. This study allows us to affirm that the spectrophotometric method for
nitrite is reliable to maintain the fundamental criteria of linearity, accuracy
and veracity.
RESUMEN
El siguiente trabajo toma datos
obtenidos en una validación real, de manera que la metodología y proceso de
validación pueda ser aprendida y verificada por los participantes, por lo cual
se realizó la validación del método colorimétrico, utilizado en la
determinación de nitritos, la matriz evaluada fue agua potable, tomado del
Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (2012), adaptado al
manual de procedimientos analíticos del “laboratorio”. El estudio se efectuó en
el Laboratorio de Aguas y Servicios Fisicoquímicos (LASEF). Los criterios de
calidad que se estimaron fueron la linealidad, intervalos de trabajo e
intervalo lineal, precisión y veracidad. En la
evaluación de la linealidad se obtuvo un coeficiente de correlación r = 0,9978
y el coeficiente de determinación, R2 = 0.9958; los mismos cumplen
con los criterios de aceptación y reflejan una muy buena correlación entre la
señal y la concentración. En la estimación de la precisión los coeficientes de
variación total se obtuvo un 2,99% para la precisión de días y analistas
diferentes, valores por debajo del límite de 0,4578. En cuanto a la veracidad,
se obtuvo porcentajes de recuperación entre 95 y 102%, evidencia de una
excelente veracidad. Este estudio nos permite afirmar que el método
espectrofotométricos para nitrito es fiable pues mantiene los criterios
fundamentales de linealidad, precisión y veracidad.
Palabras claves: Correlación, Linealidad,
Repetibilidad, Validación, Veracidad.
Las aguas ocupan un lugar especialmente
destacado dentro del interés científico por las repercusiones que tiene en
términos de consumo y uso. Por tal razón, se ha dado especial importancia a la
determinación de la composición en diversas matrices. En este estudio se busca
establecer los parámetros de calidad necesarios para la validación del método colorimétrico
y brindar evidencia objetiva de su cumplimiento, en el desarrollo de la
cuantificación de nitritos, la guía Eurachem (2005) señala las siguientes
recomendaciones para asegurar un desempeño aceptable en el uso del método:
a) Los analistas deben
familiarizarse con el método antes de usarlo por primera vez y luego debe ser
explicado por un experto en curso.
b) Se debe evaluar cuántas
muestras pueden ser analizadas a la vez.
c) Asegurarse de que se tiene
disponible todo lo que se necesita para llevar a cabo el método antes de
realizar el trabajo.
La importancia de
estudiar la concentración controlada de los nitritos (NO2-)
radica en que estos son componentes no deseados en la composición de las aguas
potables de consumo público. Su presencia puede deberse a una oxidación
incompleta del NH3 o a la reducción NO3- existentes
en el agua. La reducción de NO3- a NO2-
puede llevarse a efecto por la acción bacteriana. El agua que contenga NO2-
puede considerarse sospechosa de una contaminación reciente por materias
fecales. Algunas aguas, debido a los terrenos por donde discurren o a las
condiciones de almacenamiento, pobre en O2-, pueden
presentar cierto contenido de NO2-. En lo que respecta a
la vigilancia de las aguas de consumo público, la determinación cualitativa o
cuantitativa del NO2- nos permite detectar posibles
variaciones de calidad, ya que la presencia de NO2- es un
buen indicador de la contaminación.
Los NO2-
existentes en el agua pueden tener un efecto perjudicial sobre la salud de
quien la consuma; sobre todo en niños, porque los NO3-
son responsables de la formación de metahemoglobina, dando lugar a
metahemoglobinemia, (conocida como la enfermedad de los niños azules) y por lo
tanto a asfixia interna. También se cree que los NO2-
pueden ser causantes de nitrosaminas en el organismo humano. Se conoce que las
nitrosaminas producen cáncer de las vías digestivas superiores, y de hígado en
animales de experimentación.
Tabla 1. Normas Para Los
Valores Máximos Permitidos De Concentración Según La (DGNTI-COPANIT
21-393-99)
|
Normas Nacionales Para Agua Potable Y Residual
|
Parámetro
|
Nitritos
|
Matriz
|
Potable
|
VMP.
Nacional (mg/L)
|
1
|
VMP.
Mexicano (mg/L)
|
1
|
Volumen
(mL) mínimo de muestra
|
100
|
Conservación
|
refrigerar 4º C
|
Tiempo
máximo de almacenamiento
|
inmediato/48 horas
|
Tipo de
envase
|
plástico o vidrio
|
Alcance: aplicable para
aguas potables por el Nitriver® 3: hasta 0,30 mg/ l NO2-n. Tamaño
de la muestra: 10 mL paquete de 100 almohadas polvo.
Principio Del Método: el nitrito produce la diazotación de la
sulfanilamida, la cual forma un compuesto de complejo rosado con la
naftilendiamina, cuya intensidad de color media fotométricamente a 543 nm, es
proporcional a la concentración de
nitritos presente en la muestra de agua para la determinación de nitrito de
gama baja por el Nitriver ® 3 diazotización método USEPA.
Interferencias: la incompatibilidad química hace improbable la coexistencia de NO2-,
cloro libre y tricloruro de nitrógeno (NCl3). El tricloruro de
nitrógeno proporciona un color rojo falso cuando se añade el reactivo
cromogénico. Los iones siguientes interfieren debido a precipitación en las
condiciones de la prueba y deben estar ausentes: Sb3+, Au3+,
Bi3+, Fe3+, Pb2+, Hg2+, Ag+,
PtCl62- y VO32-.
El ion
cobre (II) puede dar lugar a
resultados bajos por catalizar la descomposición de la sal de diazonio. Los
sólidos en suspensión deben eliminarse por filtración.
Almacenamiento De La Muestra: no manipular
nunca la conservación ácida en las muestras destinadas al análisis de NO2-.
Se hace la determinación inmediatamente sobre muestras recientes para evitar la
conversión bacteriana del NO2- en NO3-
o NH3. Para la conservación a corto plazo,
durante uno o dos días, se congela a -20º C o se conserva a 4º C.
II. DESARROLLO DE LA FASE EXPERIMENTAL
La metodológica empleada consta de dos fases. Cada una con sus
correspondientes etapas. La fase se procede con la capacitación, entrenamiento por parte del
personal analista de LASEF y se verifica la capacidad del laboratorio para realizar
este estudio por medio de una prueba diagnóstica.
La
fase II consiste en planear y
ejecutar el proceso de validación del método.
Tabla
2. Período De La Validación
|
2019
|
Curva de calibración
|
LD y LQ
|
Repetitividad
|
Exactitud
|
Tratamiento de datos
|
Periodos
|
Semana
1
|
Semana
1
|
Semana
2
|
Semana
3
|
Semana
4
|
Para
los fines de una validación, se utilizan ciertas mediciones estadísticas, que
nos ayudan a establecer si el método se encuentra dentro de
un
parámetro aceptable, normalmente se determinan las siguientes:
Tabla
3. Parámetros Utilizados En El Proceso De Validación
|
Parámetros
Evaluados
|
Descriptores De Desempeño
|
Linealidad del método
|
Coeficiente de correlación, coeficiente
de determinación, desviación estándar de la regresión, desviación estándar de
la pendiente, coeficiente de variación de la pendiente, intercepto,
desviación estándar del intercepto, pruebas t para la pendiente y el
intercepto.
|
Intervalos de trabajo e intervalo lineal
|
Límite
de detección y límite de cuantificación
|
Precisión intra-analista
|
Media, desviación estándar, coeficiente
de variación, prueba de Grubbs, test de Cochran.
|
Precisión inter-analista – interdiaria
|
Media,
desviación estándar, coeficiente de variación, prueba de Grubbs, test de
Cochran.
|
Veracidad del método
|
Error relativo, porcentaje de
recuperación, coeficiente de variación, test de Cochran.
|
Análisis de datos
|
Programas
estadístico de Excel 2010.
|
2.1 Condiciones Ambientales
El
análisis fue realizado en condiciones de % humedad y temperatura controladas
las mismas oscilaron entre 20 y 23o C con 40 y 44 % de humedad.
2.2
Reactivos y Disoluciones Patrones
§ Agua
destilada con una conductividad de menor de 5 µS/cm y un pH entre 5,00 y 8,00
unidades.
§ Disolución
Madre De Nitritos: disolver 1,232 g de NaNO2 en agua y diluido a
1000 mL. 1 mL = 250 µg de N-NO2-. Preserve con 2 mL de
CHCl3. Esta disolución es estable durante seis meses.
§ Disolución
Intermedia De Nitritos: tomar 5 mL de la disolución madre de nitritos y diluya
a 250 mL; para obtener una concentración de 5 mg/L. Adicione 2 mL de
§ CHCl3
para preservar. Esta disolución es estable durante seis meses.
§ Reactivo
De Color: añada 100 mL de ácido fosfórico al 85% y 10g de sulfanilamida, a 800 mL
de agua destilada. Después que este disuelta añada 1g de dihidrocloruro de N-(1-naftil)-etilendiamina. Mezcle para
disolver y diluya a 1 L. Esta solución es estable por un mes si se conserva en
un envase oscuro en refrigeración, se puede emplear un producto comercial
Nitriver® 3.
2.3
Procedimiento
Se
utilizó el método propuesto por el Standard Methods for
Examination of Water and Wastewater (SM, 2012). Adaptado al manual de
procedimiento de análisis de LASEF.
§ Tomar
5 mL de muestra clara y filtrada de ser necesario, añadir 2 mL del reactivo
para color (o 10 mL de muestra y un sobre de Nitriver® 3) y agitar
vigorosamente, deje reaccionar al menos 15 minutos. El reactivo no disuelto no
afecta la cuantificación del método. Lea el color desarrollado a una longitud
de onda de 543 nm.
§ Curva
de calibración para un intervalo de trabaja entre 0,0 mg/L a 0,35 mg/L de N-NO2-.
Preparar las disoluciones estándar un mínimo de cinco puntos en el intervalo
lineal de matraces volumétricos clase A, a partir de la disolución intermedia
de nitratos. Realice el procedimiento descrito para la muestra y grafique la
absorbancia obtenida versus la concentración de nitrógeno de nitrito y obtenga
la recta de regresión de mejor ajuste, calcule la pendiente e intercepto.
III. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
3.1.2 Gráfico Absorbancia Vs Concentración De
Nitritos.
3.2 Límite
de Detección (LD) y Límite de Cuantificación (LQ)
Tabla
6. Datos de LD Y LQ
|
Abs
(nm)
|
Conc
(mg/L)
|
Muestra
Empleada
|
0.0038
|
0.0059
|
Agua
destilada (10mL) + Nitriver® 3
|
0.0040
|
0.0060
|
0.0039
|
0.0059
|
0.0042
|
0.0061
|
0.0041
|
0.0060
|
0.0040
|
0.0060
|
0.0044
|
0.0062
|
Media
|
0.0060
|
S
|
0.0001
|
LD
|
0.0063
|
LQ
|
0.0070
|
3.3 Precisión
Tabla 7. Datos De Repetibilidad
|
N°
|
Abs
|
Conc
(mg/L)
|
1
|
0.0058
|
0.0070
|
2
|
0.0056
|
0.0069
|
3
|
0.0069
|
0.0077
|
4
|
0.0063
|
0.0073
|
5
|
0.0064
|
0.0074
|
6
|
0.0072
|
0.0079
|
7
|
0.0056
|
0.0069
|
Media
|
0.0073
|
S
|
0.00039
|
CV
|
5.4220
|
S2
|
1.57x10-7
|
|
|
|
|
Tabla 8. Datos De
La Precisión Inter Diaria
|
|
Día 1
|
Día 2
|
Día 3
|
1
|
0.072
|
0.0079
|
0.0079
|
0.0083
|
0.0085
|
0.0086
|
2
|
0.0069
|
0.0077
|
0.0085
|
0.0086
|
0.0085
|
0.0086
|
3
|
0.0085
|
0.0083
|
0.0084
|
0.0086
|
0.0086
|
0.0087
|
4
|
0.0085
|
0.0086
|
0.0086
|
0.0087
|
0.0089
|
0.0089
|
5
|
0.0077
|
0.0082
|
0.0073
|
0.0080
|
0.0079
|
0.0083
|
6
|
0.0079
|
0.0083
|
0.0072
|
0.0079
|
0.0085
|
0.0086
|
7
|
0.0089
|
0.0089
|
0.0085
|
0.0086
|
0.0082
|
0.0085
|
Media
|
|
0.0081
|
|
0.0082
|
|
0.0085
|
S
|
|
0.00026457
|
|
0.0002651
|
|
0.0002149
|
CV
|
|
3.21%
|
|
3.26%
|
|
2.51%
|
CVtotal
|
2.99%
|
Tabla 9.
Otros Análisis Estadísticos De Los Resultados De La Repetibilidad
|
Análisis Estadístico
|
Resultado
|
Criterio de Aceptación
|
Evaluación
|
Gmáx
|
1.51
|
Gα=5%= Gα=1%
=2.482
(Si G≤Gα=5%
se acepta
Si G≥Gα=5%
y ≤Gα=1% es dudoso
Si G≥Gα=1%
se rechaza)
|
Se acepta
|
Gmín
|
1.01
|
Se acepta
|
Sr
|
3.3x10-4
|
N. A.
|
|
R
|
|
La
diferencia entre las replicas no debe ser mayor que ésta.
|
|
CVr
|
3.5
|
CVr: ≤ 3%
|
No
|
3.3.1
Precisión Inter Analista
Tabla 10. Resultados Obtenidos Para Precisión
Interanalista
|
Analista 1 (A1)
|
Analista 2 (A2)
|
Analista 3 (A3)
|
Analista 3 (A3)
|
Nº
|
Conc
|
(mg/L)
|
Abs
|
(mg/L)
|
Abs
|
(mg/L)
|
Abs
|
(mg/L)
|
1
|
0.0085
|
0.0086
|
0.0078
|
0.0082
|
0.0044
|
0.0062
|
0.0078
|
0.0082
|
2
|
0.0079
|
0.0083
|
0.0067
|
0.0076
|
0.0058
|
0.0070
|
0.0067
|
0.0076
|
3
|
0.0085
|
0.0086
|
0.0077
|
0.0082
|
0.0049
|
0.0065
|
0.0077
|
0.0082
|
4
|
0.0084
|
0.0086
|
0.0080
|
0.0083
|
0.0055
|
0.0069
|
0.0080
|
0.0083
|
5
|
0.0080
|
0.0083
|
0.0057
|
0.0070
|
0.0043
|
0.0062
|
0.0057
|
0.0070
|
6
|
0.0082
|
0.0085
|
0.0055
|
0.0069
|
0.0037
|
0.0058
|
0.0055
|
0.0069
|
7
|
0.0084
|
0.0086
|
0.0079
|
0.0083
|
0.0049
|
0.0065
|
0.0079
|
0.0083
|
Media
|
|
0.0085
|
|
0.0078
|
|
0.0065
|
|
0.0078
|
S
|
|
0.00014
|
|
0.00062
|
|
0.00042
|
|
0.00062
|
CV
|
|
1.6637
|
|
7.9670
|
|
6.5149
|
|
7.9670
|
S2
|
|
1.17x10-8
|
|
2.0x10-7
|
|
6.88x10-8
|
|
2.0x10-7
|
Tabla 11. Otros
Análisis Estadísticos De Los Resultados De Precisión
|
|
Análisis Estadístico
|
Resultado
|
Criterio
De Aceptación
|
Evaluación
|
|
Gmáx
|
A1
|
0.7071
|
Gα=5%=2.020 Gα=1%
= 2.239
(Si G≤Gα=5% .
Si G≥Gα=5% y ≤Gα=1% .
Si G≥Gα=1%
|
Se acepta
|
|
A2
|
1.3273
|
|
A3
|
0.8291
|
|
Gmín
|
A1
|
1.4142
|
|
A2
|
1.5315
|
|
A3
|
1.4278
|
|
C
|
0.4578
|
Cα=5%=
Cα=1% =
(Si C≤Cα=5%:
Si C≥Cα=5% y ≤Cα=1%: Si C≥Cα=1%:
|
Satisface
|
|
|
Tabla 12. Veracidad
|
Rango bajo
|
0.05
|
Rango medio
|
0.20
|
Rango alto
|
0.35
|
N°
|
Abs
|
(mg/L)
|
Abs
|
(mg/L)
|
Abs
|
(mg/L)
|
1
|
0.0768
|
0.0490
|
0.3166
|
0.1909
|
0.5965
|
0.3565
|
2
|
0.0747
|
0.0478
|
0.3165
|
0.1908
|
0.5914
|
0.3535
|
3
|
0.0754
|
0.0482
|
0.3140
|
0.1894
|
0.6003
|
0.3587
|
4
|
0.0873
|
0.0553
|
0.3139
|
0.1893
|
0.6037
|
0.3607
|
5
|
0.0721
|
0.0463
|
0.3189
|
0.1923
|
0.5899
|
0.3526
|
6
|
0.0760
|
0.0486
|
0.3195
|
0.1926
|
0.6041
|
0.3610
|
7
|
0.0753
|
0.0482
|
0.3199
|
0.1929
|
0.5906
|
0.3530
|
|
Promedio
|
0.0491
|
|
0.1929
|
|
0.3566
|
Para
evaluar la linealidad del método se realizo una curva de calibración se obtuvo
la ecuación de la regresión lineal
haciendo uso del método de mínimos cuadrados dando como resultado la ecuación y
= 1,67 conc + 0,0023. Se comprobó la relación lineal determinando los
coeficientes de correlación, r = 0,9978 y determinación, R2 = 0,9958
los mismos cumplen con los criterios de aceptación. El intervalo de trabajo e
intervalo lineal se evaluó con los límites de detección y cuantificación siendo
0,0063 y 0,0070 µg/L. Respectivamente y
se cumple que LQ ˃ LD. Al estimar la precisión interdías se obtuvo un
coeficiente de variación de 2,99% el mismo esta dentro de los limites aceptados
y para evaluar que no existían diferencias significativas entre la precisión de
los analistas se realizo el ensayo de Cochran donde se obtuvo un valor de 0,4578,
valor satisface el criterio de aceptación. De igual manera no hubo diferencias
significativas y los valores eran representativos lo que se determino con un
ensayo de grubbs donde todos los valores obtenidos por cada analista estaban
dentro de la misma población, como ultimo aspecto a evaluar la veracidad se
como porcentaje de recuperación en rango de concentración bajo, medio y alto 98,1
% 95,6 % y 101 %, respectivamente. Con estos valores se comprueba la veracidad
del método ya que cumplen con los límites establecidos de 90 % -110 %.
Demostrando que el análisis de nitritos por método colorimétrico es preciso y
veraz, se puede decir que el mismo cumple con los criterios básicos de
linealidad, precisión y exactitud.
IV. CONCLUSIONES
·
Se cumple con el objetivo de crear
experiencia y registrar evidencia objetiva del proceso de validación de manera
que se facilite la implementación de su uso y aplicación en diversos
parámetros.
·
De acuerdo con el carácter académico de
este artículo se podrá utilizar como punto de partida o referencia para
reproducir dicha metodología en la caracterización de otro analito de interés,
sin embargo debe tomar en cuenta la realidad de las instalaciones y factores
externos que puedan afectar la medición, de manera tal que los datos y
cantidades proporcionadas cumplirán solo una función ilustrativa.
·
En lo que compete al proceso de
validación, los parámetros de desempeño evaluados para la determinación de
nitritos por el método colorimétrico en aguas potables dieron resultados
satisfactorios, de acuerdo a los criterios básicos de aceptación de linealidad,
precisión y veracidad del método cumpliendo con los criterios establecidos, de
manera que el método es trazable y confiable para ser utilizado en el análisis
de aguas.
V. AGRADECIMIENTOS
Primero y
principal infinitas gracias a Dios, padre celestial al cual todas las cosas
están sujetas y todo lo bueno proviene de el por tal razón todas las
bendiciones en mi vida se las debo a Él.
“Yo soy la vid, vosotros los pámpanos; El que permanece en Mí, y yo en El, Este
Lleva Mucho fruto; Porque
Separados de mí nada podéis hacer.”
A
la profesora Marixa Fuentes por brindarme
su apoyo, conocimiento y disponibilidad, brindado en el desarrollo del
curso e impulsando la creación de esta guía mediante una asignación, de manera
tal que quien pueda hacer uso de ella será beneficiado, de igual manera a mis compañeros por
compartir experiencias y puntos de vista enriquecedores a quienes exhorto a ser mejores personas cada
día, agradezco ser eje de atención para ellos.
A
mis familiares, novia, amigos y todas las personas que de alguna manera
aportaron su granito de arena en la realización de mi carrera como químico y
hoy día en la formación docente, “Somos la suma de lo que nos rodea”.
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFIA
§
Standard Methods For Examination Of Wáter And
Wastewater, American Public Health Association (APHA), American Water Works, American
Water Works Association (AWWA), 22da. Edición,
2012.
§ SLR Ellison Y A Williams (Eds) Guía EURACHEM/CITAC. Cuantificación
De La Incertidumbre En La Medición Analítica, Tercera Edición, (2012) ISBN 978-0-948926-30-3.
Disponible En Www.Eurachem.Org
§
Boqué, R; Maroto, A. 2004. El Análisis
De La Varianza (ANOVA): Comparación De Múltiples Poblaciones (En Línea). Universitat
Rovira I Virgili. Tarragona, ES. Consultado 29 Nov. 2010. Disponible En
Http://Www.Quimica.Urv.Es/Quimio/General/Anovacast.Pdf
§ Nagel,
B. 2010. Seminario-Taller: Validación E Incertidumbre De Métodos Analíticos (2010,
UNACHI). Validación De Métodos Analíticos: Concepto Y Aplicaciones
(Diapositivas). David, PA. 33 Diapositivas, Color.
§ HACH,
(2005) hach water analysis handbook procedures 4th edition (DR 2800). Loveland,
Colorado, Estados Unidos: Hach company.
